JACS: Merck har samarbetat med Huanquan och Conquer Biotech för att offentligt avslöja den totala syntesprocessen för MK-0616.

01 FoU-bakgrund och utmaningar

1.1 Bakgrunden för läkemedelsutvecklingen för MK-0616

Enlicitide Decanoate (även känd som MK-0616) är den första helt de novo-designade orala makrocykliska peptid PCSK9-hämmaren avsedd för att minska lågdensitetslipoproteinkolesterol (LDL-C) och behandla aterosklerotisk hjärt-kärlsjukdom.

Som visas i figuren ovan inkluderar klassiska exempel på detta område förutom MK-0616 även antibiotikan vankomycin (2), det kemoterapeutiska medlet paklitaxel (3) och cancerläkemedlet eribulin (4). De komplexa strukturerna av föreningarna 2 och 3 innebär att deras faktiska syntes fortfarande bygger på halvsyntetiska metoder baserade på naturliga produkter; Däremot uppnådde Eisai-teamet den totala syntesen av förening 4 genom mer än 60 steg, vilket markerar en milstolpe i syntesen av polyketidföreningar.

När det gäller MK-0616 är dess kemiska struktur mycket unik: det är den första molekylen helt designad från grunden (snarare än härledd från naturliga källor); Dessutom, som en daglig oral PCSK9-hämmare avsedd för behandling av kardiovaskulära sjukdomar snarare än för onkologi eller anti-infektionsapplikationer, kommer dess globala efterfrågan vida överstiga den för konventionella innovativa läkemedel, vilket kräver produktion i en skala som sträcker sig från hundratals kilo till flera ton.

1.2   Syntetiska utmaningar och strategier

Den molekylära komplexiteten hos MK-0616 ställer höga krav på processutveckling.

Strukturella egenskaper: Även om MK-0616 härstammar från en makrocyklisk peptid som identifierats genom screening av mRNA-displayteknik, innehåller den 6 icke-kanoniska aminosyror (totalt 8 aminosyraenheter), en 37-ledad makrocykel, en ammoniumsaltsidokedja (10) och ett icke-peptid-renderande fragment av fast syntesfas (13). ineffektivt, som illustreras nedan.

Kärnutmaningarna som ska lösas

1、Stabiliteten hos polära mellanprodukter (särskilt för ammoniumsaltfragment, där motjonen måste kontrolleras genom hela processen)；

2、Selektiviteten för stängning av stor ring (kräver optimering av monteringssekvensen bland 10 block)；

3、Uppskalningsutmaningar (undvik kromatografisk rening; säkerställ skalgenomströmning mellan milligram till kilogram)；

Därför, det nyckelbeslut som forskarna föreslår är följande：

1、dela-och-härska：Prioritera konstruktionen av "Northern-fragmentet" (en 17-ledad ring som består av icke-kanoniska aminosyror i positionerna 5, 6 och 7), och förenkla den makrocykliska klyvningsstrategin genom retrosyntetisk analys (t.ex. genom att välja amidbindningen mellan positionerna 5 och 8).

2、Terminal sidokedja introduktion：Det polära ammoniumsaltfragmentet (10) ska reserveras för det sista installationssteget för att undvika utmaningar i samband med mellanliggande rening.

3、Flexibel applicering av syra–basneutraliseringsreaktioner (RCM)：En n-hexanbunden kedja bildas vid position 7–13; denna reaktion uppvisar utmärkt ortogonalitet och kan utföras i flera steg.

Genom denna serie av strategier har forskare i slutändan etablerat en skalbar syntetisk väg, vilket banar väg för klinisk utvärdering.02

02 Syntetisk strategi och optimering

Genom analytiska studier utförde forskarna flerstegsoptimering i flera generationer av det makrocykliska nyckelfragmentet (Northern-fragmentet) och optimerade sammansättningen av Southern-fragmentet med slutprodukten.

2.1 Flergenerationsoptimering av det norra segmentet:

Första generationen– 37 iterationer

Syntesen av icke-kanoniska aminosyror (t.ex. 3-hydroxiprolin) uppvisar låg effektivitet, eftersom den är beroende av ineffektiva cykliseringsreaktioner—såsom Dieckmann-kondensen—såväl som kiral upplösning; vidare kräver denna process flera omgångar av skyddsgruppsmanipulation och flera kromatografiska reningar, som illustreras i figuren nedan.

Alla dessa faktorer begränsar den storskaliga syntesen av målfragment.

Andra generationens synkronsystem

Ett genombrott uppnåddes genom biokatalys: införandet av ketonreduktion (KRED) möjliggjorde den mycket effektiva och stereoselektiva reduktionen avβ-hydroxiestrar; dessutom användes konstruerat TrpB-enzym för att syntetisera fluorerad tryptofan, vilket eliminerade behovet av kiral upplösning. Som ett resultat reducerades antalet syntetiska steg och användningen av skyddsgrupper minimerades, vilket illustreras i figuren nedan.

Denna syntetiska väg för optimering av Northern-fragmentet har också använts i klinisk utveckling; möjligheter som härrör från den strukturella strategin har emellertid skapat ett behov av ytterligare optimering av fragmentsyntesvägen.

För det första ger nyckelfynden beträffande de tre sena kristallisationsintermediärerna en kritisk punkt för renhetskontroll; därför är det väsentligt att modifiera den syntetiska vägen för att fånga upp dessa tre mellanprodukter.

För det andra rekommenderas det att utföra cyklotrimeriseringen av olefiner-reaktionen så sent som möjligt under syntesprocessen. Detta tillvägagångssätt är baserat på övervägandet att ruteniumkatalysatorer kan öka den totala kostnaden för produktion av bensotiuramin; att utföra denna reaktion i det sista steget av syntetisk väg kan således avsevärt minska kostnaderna.

Därför har detta underlättat optimeringen av tredje generationens tillvägagångssätt.

Tredje generationens gemensamt stegsystem

Genom enzymatisk hydroxylering oxideras L-prolin direkt till 3-hydroxiprolin med en stereoselektivitet som överstiger 99:1; nyckelmellanprodukter identifierades, såsom kristalliniteten hos bensensulfonatsaltet, vilket möjliggjorde undvikande av kromatografisk rening; modulär sammansättning användes, tillsammans med justeringar av aminosyrakopplingssekvensen och förenkling av skyddsgruppsstrategin, såsom illustreras i figuren nedan.

Det tredje generationens syntetiska MK-0616 Northern-fragment skiljer sig från de fragment som syntetiserats i de föregående två generationerna. Detta urval drevs av identifieringen av kristallint pentanoat 91, som saknar treoninaminosyraresten (som ska inkorporeras senare under syntesen). Detta salt kan isoleras med högt utbyte och renhet och ger en mycket stabil mellanprodukt som kan lagras som en nyckelmellanprodukt under hela syntesprocessen.

Genom optimering i tredje generationen kräver separationen av det nydesignade Northern-fragmentet (91) nu bara 14 steg—bara en tredjedel av antalet steg som krävs för den första generationens syntes. Dessutom är det viktigt att notera att i tredje generationens protokoll har den längsta linjära sekvensen reducerats med mer än hälften och minskat från 20 steg till 9 steg.

2.2 Optimering av det sydliga fragmentet

Första generationen, bestående av 15 steg

Med utgångspunkt från råvaror som anskaffats i stora kvantiteter från kommersiella leverantörer, representerar 9-stegsprocessen den längsta linjära sekvensen, som visas i figuren nedan.

Andra generationens synkronsystem

I den andra generationens syntes var det som förbättrades inte antalet steg, utan snarare den övergripande effektiviteten och renhetskontrollen, som illustreras i schemat nedan. Efter tusentals försök identifierades ett Southern blot-fragment som kallas leelaminsalt (99).

Användningen av dessa två föreningar har tidigare visats fungera som icke-kirala lösningsmedel för karboxylsyror; följaktligen kan det kristallina saltet (99) överraskande erhållas som en mycket ren substans, varigenom man undviker det omfattande preparativa HPLC-arbete som krävs i den föregående generationen av syntes.

2.3 Slutproduktmontering

Både den första generationens Northern-fragment och den andra intermediären av Southern-fragmentet kan lätt skyddas för att ge den linjära prekursorn 61, såsom visas i figuren nedan; emellertid är utbytet av cykloolefinmetatesprodukten mycket lågt.

Oavsett vilket, använde forskare framgångsrikt en annan sekvens, vilket möjliggjorde den första skalbara syntesen av MK-0616, som illustreras i schemat nedan.

Den första generationens enaldehydsalter syntetiserades via en 63-stegsprocess som börjar med installation av sidokedjor på den molekylära kärnan genom högutbytesamidering följt av SFC-rening; bland dessa steg representerar steg 28 den längsta linjära sekvensen.

Den andra generationens slutproduktkombination visas i figuren nedan.

Genom att optimera vägarna för både nordliga och sydliga fragment som riktar sig mot målprodukten, kan båda tillvägagångssätten använda kristallina mellanprodukter med platt fragment för att gå vidare till det sista steget av syntesen.

Denna kopplingsreaktion är tillräckligt ren för att fortsätta direkt till nästa steg med användning av en rå reaktion.

Sammantaget kräver andra generationens syntetiska väg för MK-0616 43 steg, bland vilka 21 steg utgör den längsta linjära sekvensen. Denna sekvens minskar både det totala antalet steg och längden på den längsta linjära sekvensen jämfört med den första generationens process med en tredjedel.

03 Nyckelteknologisk innovation

En analys av hela optimeringsprocessen avslöjar flera innovationer inom nyckelteknologier, såsom:

1、Biokatalysteknik:KRED dynamisk kinetisk upplösning; TrpB enzymmedierad syntes av tryptofananaloger; direkt införande av hydroxylgrupper via prolinhydroxylas; etc.

2. Kristallisationsdriven rening: Flera mellansteg—såsom metylsulfonatet av Northern blot-fragment eller leelaminsaltet av Southern blot-fragment—används för att uppnå kristallisationsrening, varigenom behovet av kromatografikolonner elimineras.

3. Ortogonal skyddsgruppsstrategi: flexibel växling mellan skyddsgrupper som Boc och Nosyl för att säkerställa selektiviteten av flerstegsreaktioner.

4. Grön kemi överväganden: minska användningen av tungmetallkatalysatorer (t.ex. ruteniumkatalysatorer) och flytta RCM-reaktionen till ett senare skede för att sänka produktionskostnaderna.

04 Sammanfattning och Outlook
Den här artikeln visar en flexibel integration av biokatalys och kemisk syntes, samtidigt som den betonar den centrala rollen av kristalliseringsprocesser och antar en modulär designmetod – och visar därigenom en systematisk metodik som spänner från laboratorieutforskning till produktion i industriell skala. Detta arbete representerar ett exemplariskt fall inom området komplex molekylär syntes: det totala antalet steg reducerades från 63 i den första generationens protokoll till 43 i den andra generationens protokoll, med utbyten ökade med nästan 1 000 gånger och möjliggör genomförbarheten av produktion i tonskala. Under hela processen läggs strategisk tonvikt på kristalliseringssteget, och undviker därigenom kromatografisk rening – en egenskap som gör den mycket lämplig för produktion i tonskala. Dessutom tillhandahåller denna studie en teknisk mall för de syntetiska metoderna för andra komplexa makrocykliska peptider.