Biokatalytiska kaskader möjliggör tillverkning av den makrocykliska peptiden Enlicitide

MSD:s prövningsbara orala PCSK9-hämmare, enlicitidekanoat (MK-0616), är den första orala makrocykliska peptid-PCSK9-hämmaren som visar betydande LDL-C-sänkning hos människor. Enlicitide utvecklades från en mRNA-visningsskärm av monocykliska peptider och stabiliserades därefter genom icke-peptidiska tvärbindningar för att generera en struktur innefattande tre sammansmälta makrocykler. Denna komplexa oktapeptid innehåller sex onaturliga och två proteinogena aminosyror förbundna med 12 amidbindningar och en central kedjelänk med sex kol. Traditionell kemisk syntes kräver 43 steg, skyddsgruppsmanipulationer (nästan hälften av de syntetiska stegen), kromatografiska reningar och ett mycket utspätt ruteniumkatalyserat metatessteg för ringslutning, vilket begränsar skalbarhet och hållbarhet.

Kemoenzymatisk tillverkningsutveckling

MSD-forskarna utvecklade en kortfattad och konvergent kemoenzymatisk process för att tillverka enlicitidekanoat (1) som möjliggörs genom direkt koppling av monomerer med aminosyraligaser, kombinerat med biokatalytisk peptidfragmentligering och makrocykliseringar med användning av esteraser och iminreduktaser.

Nyckelprestationer

Tre-enzym kaskadsammansättning med ATP-gripligaser

- Tre-enzymkaskad (två konstruerade ATP-greppligaser + ATP-återvinning) sätter ihop en tetrapeptid från oskyddade aminosyror. ATP-gripligaser (specifikt ATP-beroende aminosyraligaser, AAL) är enzymer som katalyserar amidbindningsbildning mellan oskyddade aminosyror eller peptider med hjälp av ATP som energikälla. Deras mekanism fortskrider genom en blandad anhydridmellanprodukt, som tillåter direkt koppling utan att behöva skyddsgrupper på den nukleofila aminen eller aktiverade acyldonatorerna. I den här studien använde forskarna ett ATP-greppligas från Bifidobacterium adolescentis (BaAAL) och konstruerade varianter (Trp-BaAALEng och Phe-BaAALEng) för att selektivt utöka en dipeptid med två icke-naturliga aminosyror (tryptofan och fenylalanin-analoger) i en kaskad. Dessa ligaser har en smal, nedgrävd elektrofilficka som accepterar enstaka aminosyror som elektrofiler (C-terminala substrat) men kan hysa längre peptider som N-nukleofiler. Denna selektivitet gör dem idealiska för sekventiell, skyddande gruppfri peptidsammansättning från C-terminalen till N-terminalen. Den ATP som konsumeras återvinns med hjälp av ett polyfosfatkinas (FbPPKWT) med billigt hexametafosfat som fosfatgivare.

Konstruerad esteras (RsEstEng) regioselektiv makrolaktamisering

- Konstruerat esteras (RsEstEng) katalyserar regioselektiv makrolaktamisering för att bilda Northern-fragmentet (73 % utbyte, 52 kg skala). RsEstEng härrör från ett vildtypskarboxylesteras (RsEst) identifierat från Roseibacillus sp. Dess naturliga funktion är hydrolys av esterbindningar. Genom riktad evolution omvandlade forskarna den till en katalysator för regioselektiv makrolaktamisering – bildandet av en makrocyklisk amidbindning – i syntesen av det nordliga fragmentet (4) av enlicitid. Den accepterar den stabila, skrymmande tert-butylestern av den linjära tetrapeptiden (9) som acyldonator för att producera den makrocykliska peptiden (4) för att bilda en intramolekylär amidbindning. Den uppnådde selektiv cyklisering utan detekterbara oligomerer och endast 0,8 % esterhydrolysbiprodukt, även under förhållanden med hög jonstyrka från den tidigare enzymkaskaden.

Konstruerad tioesteras (BlTEEng) intermolekylär ligering

- Konstruerat tioesteras (BlTEEng) utför intermolekylär ligering av Northern (4) och Eastern fragment (3) utan epimerisering. BlTEEng är en modifierad version av en tioesterasdomän (TE) som ursprungligen skurits ut från det icke-ribosomala peptidsyntetaset (NRPS) av Brevibacillus laterosporus (BlTE). Tioesteraser av vildtyp i NRPS-system katalyserar typiskt makrocyklisering eller frisättning av linjära peptider från ett bärarprotein via en tioesterbindning. De konstruerade varianterna av BlTE visade viss aktivitet men gynnade dimera biprodukter. Enzymteknik flyttade enzymet för att katalysera intermolekylär ligering med mer stabila isopropyloxoestrar istället för de naturliga, hydrolytiskt labila tioestrarna.

Fyra enzymkaskadreduktiv amineringsmakrocyklisering

- Fyra-enzymkaskad (PsIREDEng, KsKREDEng och kofaktoråtervinningsenzymer StLDHWT, TvADHWT) uppnår reduktiv amineringsmakrocyklisering för att bilda en bicyklisk diamin (69 % utbyte, 46 kg skala). KsKREDEng är ett konstruerat ketoreduktas från Kyrpidia sp. Det katalyserar oxidationen av en bensylalkoholförening (10) till en övergående aldehyd (11) beroende på NAD+. PsIRED är ett iminreduktas från Pseudogymnoascus sp. Det är NADPH-beroende. PsIREDEng katalyserar den reduktiva amineringen av aldehyden (11) och den befintliga aminen för att bilda den cykliska iminen (12), följt av reduktion till den sekundära aminmakrocykeln (13). StLDHWT regenererar NAD+ för det oxidativa steget genom att reducera pyruvat till laktat, medan TvADHWT regenererar NADPH för det reduktiva steget genom att oxidera isopropanol till aceton.

Slutlig makrocyklisering via konstruerat PBP-tioesteras

- Kemisk koppling med Western-fragmentet (2), följt av konstruerat penicillinbindande proteintioesteras (SsPBP-TEEng), stänger den slutliga makrocykeln vid hög koncentration (70 g/L) – övervinner den typiska utspädningsbegränsningen (5 g/L i traditionell syntes). Den övergripande processen inkluderar tre kaskadsteg, 7 konstruerade + 3 hjälpenzymer, 39 % totalt utbyte, demonstration i multikilogramskala, >99 % renhet, ingen kromatografi och inga skyddsgrupper. Detta arbete ger en hållbar, skalbar plan för tillverkning av komplexa makrocykliska peptider, vilket dramatiskt minskar antalet steg och slöseri samtidigt som effektiviteten och patienttillgången förbättras.