Naturliga peptider är utmärkta "molekylära nycklar" - de har hög affinitet, bra selektivitet och låg toxicitet. Men de har tre stora svagheter: de skärs lätt upp av proteaser, har svårt att penetrera cellmembran och stannar i kroppen för kort tid. Under de senaste tre decennierna har läkemedelspersonal systematiskt åtgärdat dessa brister med en "verktygslåda med speciella aminosyror". Den här artikeln använder klarspråk och ett stort antal diagram för att vägleda CMC FoU-kamrater att demontera och förstå denna verktygslåda från princip till implementering.
I. Varför är naturliga peptider "otillräckliga"
II. Översikt över fem stora modifieringsstrategier
III. N-metylering
IV. a-metylering och Aib
V. Aminosyror med D-konfiguration
VI. Icke-naturliga aminosyror
VII. Omfattande fall: Hur görs orala peptider
VIII. En snabbreferenssida för CMC-kamrater
IX. Framtida designtrender: AI och displayteknik
Att använda en naturlig polypeptid (som helt består av 20 aminosyror av L-typ) direkt som medicin varar ofta inte i mer än några minuter. Anledningen kan sammanfattas i en mening: Det mänskliga ämnesomsättningssystemet är i sig utformat för att känna igen och bryta ner denna struktur. Det manifesteras specifikt som fyra inbördes relaterade frågor.
①Proteasnedbrytning - Den mest dödliga plasman, levern, njurarna och mag-tarmkanalen är fyllda med peptidaser/proteaser (som DPP-4, aminopeptidas, karboxipeptidas, trypsin, etc.), som specifikt känner igen amidbindningar av L-typ och hydrolyserar dem. Halveringstiden för naturligt GLP-1 i kroppen är bara cirka 1,5 till 2 minuter.
②Dålig membranpermeabilitet och svår oral administrering: Den stora mängden amid N-H på polypeptidskelettet är en stark vätebindningsdonator och är tätt omsluten av vattenmolekyler, vilket gör det svårt att passera genom cellmembranets hydrofoba kärna. Detta är den grundläggande anledningen till att de allra flesta peptider endast kan administreras genom injektion.
③Med kort halveringstid och snabb renal clearance filtreras polypeptider med liten molekylvikt (<5 kDa) snabbt och rensas bort av glomerulus. Tillsammans med enzymatisk hydrolys är exponeringsnivån i kroppen svår att upprätthålla och frekvent administrering krävs.
④Linjära polypeptider med konformationsflexibilitet och dålig selektivitet är som "mjuka nudlar" i lösning, med otaliga konformationer som snabbt vänder. När man binder till målet är entropiförlusten stor, affiniteten diskonteras och den kan också felaktigt binda till flera relaterade receptorer, vilket leder till off-target.
Den "speciella aminosyra"-strategin är i huvudsak en exakt reparation av dessa fyra svaga punkter: utan att störa den farmakodynamiska konformationen, modifierar den skelettet och sidokedjorna, vilket gör att molekylen kan "undvika" enzymigenkänning, "ta bort" överflödiga vätebindningar och "låsa" den aktiva konformationen, samtidigt som målet bibehålls så mycket som möjligt.
Använd först en tabell för att skapa en övergripande förståelse. Följande fem typer av modifieringar är de mest använda "speciella aminosyra"-metoderna i modern peptidläkemedelsdesign, och de kommer att utvecklas en efter en i de efterföljande kapitlen.
N-metylering är processen att ersätta vätet (n-H) på kväveatomen i skelettets amidbindning med en metylgrupp (n-CH3). En till synes mindre förändring kan samtidigt utlösa fyra nyckelparametrar för farmakokinetiken. Dess verkningsmekanism kan delas upp i tre nivåer.
Varje N-H är en stark vätebindningsdonator som "nålar" molekylen i vattenfasen. N-metylering raderar denna donator minskar molekylens polära ytarea (PSA), vilket tillåter molekylen att "dehydrera" och komma in i membranets hydrofoba kärna. N-metyleringseffekterna på flera ställen kan överlagras - den klassiska Veber-Hirschmann somatostatinanalogen, efter N-metylering på tre ställen, har en oral biotillgänglighet på cirka 10 %.
Metylgruppen upptar utrymmet nära amidbindningen. Den proteasaktiva fickan kan inte korrekt "bita" klyvningsbindningen, vilket avsevärt förbättrar den metaboliska stabiliteten. Detta är den fysikaliska grund på vilken N-metylering är direkt kopplad till resistens mot enzymatisk hydrolys.
Vanliga amidbindningar är nästan alla trans (trans), medan N-metylering för energiskillnaden mellan cis (cis) närmare, vilket gör det lättare att växla mellan cis-trans konformationerna. Designers kan därigenom "inducera" molekyler att vika sig till specifika aktiva konformationer eller bilda intramolekylära vätebindningar för att dölja polära grupper (för att ytterligare underlätta penetration).
Detta immunsuppressiva medel är en lärobok om "synergistisk funktion av speciella aminosyror". Det är en cyklisk peptid med 11 rester som innehåller 7 skelett-N-metyleringar och en D-alanin. Det är just denna täta N-metylering och cyklisering som gör att den kan bibehålla oral aktivitet samtidigt som den har extremt stark metabolisk stabilitet - den kan "växla kläder" mellan vattenlösning och membranmiljö, bilda intramolekylära vätebindningar för att dölja polariteten och passera genom membranet, och sedan öppna för att binda till målet i vattenfasen. Cyklosporin har därmed blivit en av de få naturliga källorna till "beyond Rule of Five" makrocykliska peptider som kan absorberas oralt.
N-metylerade aminosyror är sekundära aminer med steriskt hinder med låg kopplingseffektivitet, långsam reaktion och är mycket benägna för racemisering och diketopiperazin (DKP) trunkering. Starkare kopplingsreagens (som HATU/COMU + tillsatser), utökad kopplingstid eller dubbelkoppling, strikt temperaturkontroll och onlineövervakning av varje steg krävs. Platsval är mycket känsligt: N-metylering vid olika ställen i samma sekvens kan ha mycket olika effekter på aktivitet och penetration och screening ställe för ställe krävs.
N-metylering involverar vätet på kväveatomen. α-metylering involverar vätet på α-kolet. När det ursprungliga vätet på α-kolet ersätts med en metylgrupp, ändras α-kolet från ett "trisubstituerat" till ett "tetrasubstituerat kvaternärt kol" (det mest typiska exemplet är Aib, 2-aminoisosmörsyra, vilket motsvarar att lägga till ytterligare en metylgrupp till α-kolet i alanin, och är symmetrisk på båda sidor). Detta ger en trippeleffekt.
Konformationell låsning (de flesta kärnor)
Antiproteas
Eliminera kirala svagheter
Naturlig GLP-1 skärs exakt från den åttonde positionen av N-terminalen av DPP-4, med en halveringstid på endast 1,5 till 2 minuter. Det viktigaste draget för semaglutid är att ersätta alanin (Ala8) i den 8:e positionen med Aib (α,α-disubstituerad) - det steriska hindret av kvartärt kol gör att DPP-4 "inte kan bita" denna plats, vilket blockerar den huvudsakliga nedbrytningsvägen från källan.
Tre på varandra följande ändringar har förlängt halveringstiden från minuter till en vecka:
① Aib8 består av DPP-4-skärning;
② Arg34-ersättning undviker nedbrytning på en annan plats och bidrar till den platsspecifika lipideringen.
③ Lys26 långkedjig fettdisyra (C18 disyra + linker) binder reversibelt till serumalbumin och undviker renalt clearance.
Omfattande resultat: Halveringstiden är cirka 165 timmar (cirka 1 vecka), och den kan administreras en gång i veckan.
Aib är också en sterisk hindrande aminosyra, med långsam koppling. Aib-aib eller AIB-följda aminosyror kräver ofta dubbelkoppling eller stark aktivering. Det är värt att notera att Aibs "onaturliga" status utgör hinder för den rekombinanta jäsningsvägen (ribosomer känner inte igen det). Därför förlitar sig peptider som innehåller Aib såsom Simaglutid vanligtvis på solidfassyntes (SPPS) eller solidfas + fermentationshybridstrategier och kombineras med platsspecifik modifiering av fettsyrasidokedjor. Komplexiteten i process- och kvalitetskontroll är betydligt högre än för vanliga rekombinanta peptider.
Den aktiva fickan av proteas är en "handske" skräddarsydd för L-substrat. När D-aminosyror ersätts nära klyvningsbindningen, störs det geometriska förhållandet mellan substratets karbonylgrupp och den enzymkatalyserade triaden. Klyvningsbindningen kan inte placeras i rätt reaktionsposition, bindningsaffiniteten sjunker kraftigt och hydrolysen avbryts därmed.
Vänder om hela sekvensen samtidigt som varje rest ersätts med en D-formad. Magin ligger i det faktum att det relativa arrangemanget av sidokedjorna i rymden till stor del behålls, vilket bevarar den ursprungliga aktiviteten. Skelettet är dock helt D, helt immunt mot proteaser, och immunogeniciteten är avsevärt reducerad. Detta är ett kraftfullt verktyg för att designa blod-hjärnbarriär-shuttle-peptider och långverkande peptider.
Råvarupriset för D-aminosyror är vanligtvis högre än för L-typ och det finns färre leverantörer. Uppmärksamhet bör ägnas åt kontrollen av kiral renhet (ee-värde) och enantiomerföroreningar.
Förutom de ovan nämnda modifieringarna på skelettnivå, har läkemedelspersonal också hundratals kommersialiserade "välskyddade och välaktiverade" icke-naturliga aminosyrabyggstenar att välja mellan. De är som legos, sammansatta i sekvenser efter funktion.
"Särskilda aminosyror" adresserar molekylär stabilitet och konformation. För att göra polypeptider till orala läkemedel finns det faktiskt två oberoende men överlagrade vägar att "komma in".
Det första steget: Överleva. Speciella aminosyror (Aib, N-metylerad, D-typ) motstår nedbrytning av gastrointestinala proteaser.
① Intrinsic Molecular Permeation: N-metylering minskar vätebindningar /PSA, cyklisering + hydrofoba sidokedjor främjar intramolekylära vätebindningar och "kameleon"-veckning.
② Beredningspenetrationsfrämjande: SNAC, natriumdekanoat och TPE öppnar/korsar temporärt den intestinala epitelbarriären.
Det tredje steget: Behåll fettsyrasidokedjan bindande albumin/långverkande konformation för att upprätthålla exponeringen av blodläkemedel.
Framtida molekyler kommer att innehålla fler och fler "knepiga" icke-naturliga aminosyror och makrocykliska strukturer.
mRNA-display (som RaPID-systemet) kan screena peptidbibliotek i skalan 10¹² - 10¹³ på en gång.
RFdiffusion, modifierad AlphaFold (såsom den cykliska peptidpositionskodningen av AfCycDesign) och förstärkningsinlärningsgeneratorer har kunnat designa stora cykliska/bindande peptider från grunden.
Sidokedje-olefinbindande låsande α-helix, vätebindningssubstitution, β/γ-aminosyrafoldamer och skelettteknik på atomnivå löser gradvis det traditionella problemet med att rikta in sig på intracellulära protein-proteininteraktioner (PPI).
Användningen av platsspecifika konjugationsställen tillhandahållna av icke-naturliga aminosyror för att fästa toxiner, nuklider eller fluorescens, vilket skapar en "peptidversion ADC". Samtidigt blir tekniken för främjande av oral penetration allt mognare. "Särskilda aminosyror + preparat" kommer att möjliggöra att fler polypeptider som ursprungligen bara var injicerbara kan tas oralt.
![N-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluorfenoxi)fenoxifosfinyl]-L-alanel-metyletylester](/upload/8820/n-s-2-3-4-5-6-pentafluorophenoxy-phenoxyphosphinyl-l-alaninel-methylethyl-ester-67039.webp "N-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluorfenoxi)fenoxifosfinyl]-L-alanel-metyletylester")
